注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Dihydrophaseic acid3-辛基噻吩 98%氯 AR,99.5 %（）

Drim-7-ene-11,12-diol acetonide9-苯基咔唑 98%汞 ACS（）

Ebenifoline E-II9, 9′-螺雙芴 98%化汞 AR,99.5%（）

enantio-7(11)-Eudesmen-4-ol二亞芐叉酮 98%化汞 CP,99.0%（）

Enhydrin chlorohydrin3-酸叔丁酯 97 AR,98.5%（）

Epicurzerene三特丁基膦 1.0 M in toluen CP,98.0%（）

epi-Eudesmol噻吩-2,3-二甲 98%GR,99.0%（）

Epipterosin L 2’-O-glucosidealpha-三聯(lián)噻吩 99%紅AR,99.5%（）

Epipterosin L三(二亞芐基酮)二鈀，氯加合物 98%黃色AR,99.5%（）

Epitulipilide三(2-甲苯基)膦 97%乙 AR,98.0%（）

Epitulipilide diepoxide四（三苯基膦）鈀(0) 99.8% metals basis, Pd 9.0%溴 AR,99.5%（）

Epoxyparvilide2,2',7,7'-四溴-9,9'-螺二芴 98% CP,99.0%（）

Eucalyptone2-乙酰基-5-降冰片烯  95%硝酸亞汞 CP,98%

Eudesm-4(15)-ene-3alpha,11-diolN-乙烯基咔唑 98%汞溴紅 24～27%

beta-Eudesmol4,5-雙二苯基膦-9,9-二甲基氧雜蒽  98%硫酸汞 CP,98.0％（）

Eupalinilide B2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶 99%硫酸汞 AR,99.0％（）

L-酪氨酸二鈉鹽(>98%,BC)Phospho-Chk1 (Ser317) Antibodyphospho-EGFR (Tyr1197)  磷酸化表皮生長因子受體抗體

魯米諾鈉(>98%,BS)Phospho-Chk1 (Ser317) AntibodyPhospho-EGFR (Tyr1172)  磷酸化表皮生長因子受體抗體

溴-6氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(>98%,BR)Phospho-Chk1 (Ser317) Antibodyphospho-EGFR (Tyr1172)  磷酸化表皮生長因子受體抗體

溴-6氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(>98%,BR)Phospho-Chk1 (Ser280) AntibodyPhospho-EGFR (Tyr1138)  磷酸化表皮生長因子受體抗體

檸檬酸鎂九(>98%,BR)SETD2 (D5T1Q) Rabbit mAbphospho-EGFR (Tyr1125)  磷酸化表皮生長因子受體抗體

十二烷基硫酸鎂(分子生物學(xué))Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAbphospho-EGFR (Tyr1110)  磷酸化表皮生長因子受體抗體

氟化鎂(>98%,BR)Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAbPhospho-EGFR (Tyr1101)  磷酸化表皮生長因子受體抗體

氫氧化鎂(>99%,BR)Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAbphospho-EGFR (Tyr1092)  磷酸化表皮生長因子受體抗體

無高氯酸鎂(>98%,BC)POMC (D3R1U) Rabbit mAbphospho-EGFR (Tyr1068)  磷酸化表皮生長因子受體抗體

硬脂酸鎂Phospho-Chk1 (Ser296) Antibodyphospho-EGFR (Tyr1016)  磷酸化表皮生長因子受體抗體
葡萄球菌屬通用PCR檢測試劑盒廠家魚類皮質(zhì)醇(Cortisol)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃500U

魚類*狀腺原氨酸(T3)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1克

魚類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100毫克

魚磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：5克

魚卵黃高磷蛋白(PV)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100毫克

魚孕激素/孕（PROG）ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1克

圓環(huán)病毒IgGELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1米

植物25羥基維生素D3(25(OH)D3/25HVD3)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：保存：-20℃50毫克
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。